Une autre activité qui a contribué à la renommée de l’hôpital fut l’établissement en son sein d’une prestigieuse école de musique, issue d’une tradition ancienne déjà mentionnée dans le Liber Regulae Sancti Spiritus. De grands musiciens tels que Pasquini, Frescobaldi et Zoilo se sont succédé pour enseigner le chant, le clavecin, l’orgue et la flûte, orientant ainsi les jeunes élèves vers des carrières musicales. La musique était également considérée comme un soutien précieux dans le soin des patients. Un orgue, placé entre les deux salles de l’hôpital, apportait du réconfort aux malades durant leurs longues journées d’hospitalisation, et l’on croyait que le son de la flûte, pendant l’allaitement, favorisait l’écoulement du lait.