Un’altra attività che ha reso celebre l’Ospedale è stata l’istituzione al suo interno di una prestigiosa scuola di musica, che trae origine da una consuetudine antica già citata nel Liber Regulae Sancti Spiritus . Musicisti di grande rilievo, come Pasquini, Frescobaldi e Zoilo, si sono alternati nell’insegnamento di canto, cembalo, organo, flauto, ed hanno orientato i giovani allievi verso professioni musicali. La musica era inoltre ritenuta un utile supporto alla cura del paziente. Un organo posto fra le due Corsie recava sollievo ai ricoverati durante le lunghe giornate di degenza, ed era convinzione che il suono del flauto, durante l’allattamento, favorisse il flusso del latte.