L’Ospedale, che in seguito prese il nome di Corsia Sistina, fu impreziosito da un ciclo di affreschi di scuola umbro laziale (XV sec.), commissionati dallo stesso pontefice, aventi lo scopo di narrare i momenti significativi della sua vita e la storia dell’antico edificio innocenziano. La Corsia Sistina, sormontata da un tiburio, conserva al suo interno un ciborio attribuito ad Andrea Palladio e un’opera pittorica di Carlo Maratti. Ad Andrea Bregno è attribuito il portale in marmo detto “del Paradiso”. Pio V (1566 – 1572) ampliò l’Ospedale con la costruzione del Palazzo del Commendatore, ad opera dell’architetto Giovanni Lippi (detto Nanni di Baccio Bigio) e gestito da Monsignor Bernardino Cirillo.

Il Palazzo, costruito attorno ad un elegante cortile quadrangolare, è ornato da una fontana donata da Alessandro VII (1655-1667) e da un orologio a sei ore, voluto dal commendatore Ludovico Gazzoli. L’edificio ospita l’antica Spezieria, luogo in cui furono condotte numerose ricerche farmaceutiche, dove vennero triturate le erbe medicamentose, di cui oggi ne sono testimoni le collezioni di antichi vasi e mortai. Al piano nobile sull’elegante loggiato si affaccia il Salone del Commendatore, magnificamente decorato da affreschi narranti la storia dell’antico Ospedale. Sotto il pontificato di Clemente XI (1700-1721) è stata fondata la Biblioteca Lancisiana da Giovanni Maria Lancisi, medico e archiatra pontificio, per l’utilità dei giovani medici tirocinanti dell’Ospedale Santo Spirito. Con Alessandro VII (1655-1667) il Complesso ospedaliero di Santo Spirito si sviluppò ulteriormente, con l’edificazione della Sala ospedaliera Alessandrina, oggi adibita a sede del Museo di Storia dell’Arte Sanitaria.

Con Benedetto XIV (1724-1730) fu ulteriormente ampliato con la costruzione della perduta “Corsia Benedettina”, demolita all’inizio del XX secolo a favore della sistemazione del Ponte Vittorio e dei muraglioni del Tevere. Il prospetto orientale venne ricostruito su modello dell’antico Ospedale sistino e sul versante del lungotevere in Sassia vennero aggiunti altri edifici, sede dei moderni reparti dell’attuale Ospedale del Santo Spirito.

Il nucleo collezionistico originario si formò nella seconda metà del Settecento ed era costituito dal materiale utilizzato a scopo didattico per le lezioni di teoria tecnico-scientifica (altri musei in Italia, conservano questo tipo di materiale, come Palazzo Poggi a Bologna o La Specola a Firenze).
Nel corso dell’Ottocento si alternarono una serie di importanti personaggi a partire da Giuseppe Flajani, per arrivare al chirurgo di Pio IX Giuseppe Costantini, i quali si dedicarono con passione a riordinare e arricchire la raccolta con nuove collezioni. Dalla presa di Roma in poi, però, la struttura perse progressivamente la sua vitalità.  L’ospedale infatti, fondato da Papa Innocenzo III  aveva tra i suoi compiti anche quello dell’insegnamento della medicina, ed era perciò dotato di una ricca Biblioteca, del Teatro anatomico e della Speziera.

Fu soltanto nel 1911 in occasione delle “Mostre Retrospettive”, organizzate a Castel Sant’Angelo per l’Esposizione Internazionale di Roma, che venne avanzata l’idea di creare l’odierno museo. Nella sezione dedicata all’arte sanitaria era stata allestita una ricca esposizione di oggetti provenienti da varie collezioni private ed erano state inoltre ricostruite una farmacia romana del XVII secolo e un laboratorio alchemico (con il modello della porta alchemica realmente esistente a Roma).