El hospital, que más tarde tomó el nombre de Corsia Sistina, fue embellecido por un ciclo de frescos de la escuela umbro-lazio (siglo XV), encargados por el propio pontífice, que pretendían narrar momentos significativos de su vida y de la historia del antiguo edificio inocentino. La Sixtina, coronada por un tiburón, contiene un copón atribuido a Andrea Palladio y una pintura de Carlo Maratti. El portal de mármol conocido como «del Paradiso» se atribuye a Andrea Bregno. Pío V (1566 – 1572) amplió el hospital con la construcción del Palacio del Comendador, obra del arquitecto Giovanni Lippi (conocido como Nanni di Baccio Bigio) y dirigido por monseñor Bernardino Cirillo.

El palacio, construido en torno a un elegante patio cuadrangular, está adornado con una fuente donada por Alejandro VII (1655-1667) y un reloj de seis horas, encargado por el comendador Ludovico Gazzoli. El edificio alberga la antigua Spezieria, lugar donde se llevaban a cabo numerosas investigaciones farmacéuticas, donde se trituraban hierbas medicinales, de las que hoy son testimonio las colecciones de antiguos vasos y morteros. En la planta principal, la elegante logia está presidida por el Salone del Commendatore, magníficamente decorado con frescos que narran la historia del antiguo hospital. Bajo el pontificado de Clemente XI (1700-1721), Giovanni Maria Lancisi, médico y arquitecto papal, fundó la Biblioteca Lancisiana en beneficio de los jóvenes médicos en formación del Hospital del Santo Spirito. Bajo Alejandro VII (1655-1667) se siguió desarrollando el Complejo Hospitalario del Santo Spirito, con la construcción de la Sala Hospitalaria Alessandrina, que actualmente alberga el Museo de Historia del Arte Sanitario.

Bajo Benedicto XIV (1724-1730) se amplió aún más con la construcción de la perdida «Vía Benedictina», demolida a principios del siglo XX en favor del arreglo del puente Vittorio y los terraplenes del Tíber. La fachada oriental se reconstruyó siguiendo el modelo del antiguo Hospital Sixtino y en el lado del terraplén del Tíber, en Sassia, se añadieron otros edificios que albergan los pabellones modernos del actual Hospital del Santo Spirito.

El núcleo original de la colección se formó en la segunda mitad del siglo XVIII y estaba constituido por material utilizado con fines didácticos en las clases de teoría técnico-científica (otros museos de Italia conservan este tipo de material, como el Palazzo Poggi de Bolonia o La Specola de Florencia).
Durante el siglo XIX se sucedieron una serie de personalidades importantes, empezando por Giuseppe Flajani y terminando por el cirujano de Pío IX, Giuseppe Costantini, que se dedicaron con pasión a reorganizar y enriquecer la colección con nuevos fondos. Sin embargo, a partir de la toma de Roma, la estructura fue perdiendo su vitalidad. De hecho, el hospital, fundado por el papa Inocencio III, también tenía entre sus cometidos la enseñanza de la medicina, por lo que estaba dotado de una rica Biblioteca, del Teatro Anatómico y de la Speziera.

Fue en 1911, con motivo de las «Exposiciones retrospectivas», organizadas en Castel Sant’Angelo para la Exposición Internacional de Roma, cuando se planteó la idea de crear el museo actual. En la sección dedicada al arte sanitario, se había montado una rica exposición de objetos procedentes de diversas colecciones privadas, y también se habían reconstruido una botica romana del siglo XVII y un laboratorio alquímico (con un modelo de la puerta alquímica que existió realmente en Roma).