Les salles sont composées de deux ailes, séparées par un tambour. De grandes fenêtres ont été disposées régulièrement au sommet des murs sur tout le périmètre des salles afin d’éclairer et d’aérer le vaste espace sans incommoder les patients, qui reposaient dans des lits à baldaquin. Le plafond à caissons est orné de frises entrecoupées du blason de l’hôpital—la croix à double traverse—reproduites lors des restaurations du XIXe siècle d’après les modèles d’origine.

Les fresques, comprenant 46 panneaux principaux et 23 plus petits, ont été réalisées par des peintres anonymes des écoles ombro-laziale-marchigiane à la fin du XVe siècle. Elles s’étendent sur environ 1 200 mètres et s’élèvent à environ 8 mètres du sol, suivant tout le périmètre des salles. Les scènes, rythmées par de fausses pilastres décorées de candélabres, illustrent les épisodes les plus marquants de la vie et de l’œuvre des deux papes fondateurs, Innocent III et Sixte IV. À la base de chaque panneau, des légendes en latin de Bartolomeo Sacchi, dit Platina, accompagnent les représentations. Au XVIe siècle, le Commandeur Teseo Aldrovandi fit recouvrir les murs des deux ailes de précieux cuirs repoussé, aujourd’hui disparus.

La légende de la fondation de l’hôpital, à la fin du XIIe siècle, raconte le rêve effrayant du pape Innocent III : dans la région du Vatican, des pêcheurs découvrent dans les eaux du Tibre de nombreux corps sans vie de nouveau-nés, jetés dans le fleuve par leurs propres mères. Avec révérence, les pêcheurs les présentent au pape, qui, bouleversé et horrifié, détourne le regard de cette vision épouvantable. Le panneau central, d’auteur inconnu, recouvrant en partie la scène originale de la macabre pêche, fut ajouté au XVIIIe siècle pour atténuer l’horreur que cette image pouvait provoquer chez les patients de l’hôpital.

La dure réalité de l’époque confirmait malheureusement cette pratique cruelle, ce qui poussa le pape à fonder un établissement destiné à accueillir les enfants abandonnés, les pauvres et les femmes seules, tout en offrant des soins médicaux gratuits à tous. Dans un rêve, un ange indiqua au pape d’ériger l’hôpital à l’emplacement de l’ancienne Schola Saxonum, encore propriété du roi Jean sans Terre, qui la lui offrit. Baptisé Sainte-Marie in Sassia, l’œuvre caritative et hospitalière de l’établissement reposait sur la règle énoncée dans le Liber Regulae, de l’Ordre Hospitalier du Saint-Esprit, fondé par Guido de Montpellier, son premier maître, selon laquelle « le malade est le maître et le médecin son serviteur ». Ce principe se répandit rapidement en Europe et fut adopté par de nombreux hôpitaux.

Le premier panneau illustrant la vie de Francesco della Rovere montre sa mère, Luchina, qui, sur le point d’accoucher, a une vision des saints François et Antoine. Ceux-ci lui tendent l’habit et la corde franciscains, lui annonçant ainsi le destin de son enfant. Les scènes suivantes représentent la naissance de Francesco, son baptême et l’épisode où sa mère fait vœu à saint François d’habiller son fils du froc franciscain, afin qu’il intercède pour sa guérison d’un mal qui l’a frappé. Elle renouvelle son vœu après un nouvel évanouissement de l’enfant. Enfin, le jeune Francesco, tombé à la mer depuis les falaises de Savone, est miraculeusement sauvé par les saints François et Antoine (attribution à Melozzo da Forlì). Au-dessus des panneaux apparaissent les figures d’Isaïe et d’un autre prophète.