L’hôpital, qui prit ensuite le nom de Corsia Sistina, fut embelli par un cycle de fresques de l’école d’Ombrie-Lazio (XVe siècle), commandées par le pontife lui-même et destinées à raconter les moments importants de sa vie et de l’histoire de l’ancien édifice innocentien. La ruelle Sixtine, surmontée d’un tiburium, contient un ciboire attribué à Andrea Palladio et une peinture de Carlo Maratti. Le portail en marbre dit « du Paradis » est attribué à Andrea Bregno. Pie V (1566 – 1572) agrandit l’hôpital en construisant le palais du Commendatore, œuvre de l’architecte Giovanni Lippi (connu sous le nom de Nanni di Baccio Bigio) et dirigé par Monseigneur Bernardino Cirillo.

Le palais, construit autour d’une élégante cour quadrangulaire, est orné d’une fontaine offerte par Alexandre VII (1655-1667) et d’une horloge à six heures, commandée par le Commendatore Ludovico Gazzoli. Le bâtiment abrite l’ancienne Spezieria, un lieu où étaient menées de nombreuses recherches pharmaceutiques, où l’on broyait les herbes médicinales, dont témoignent aujourd’hui les collections de vases et de mortiers anciens. Au rez-de-chaussée, l’élégante loggia est surplombée par la salle du Commendatore, magnifiquement décorée de fresques relatant l’histoire de l’ancien hôpital. Sous le pontificat de Clément XI (1700-1721), la bibliothèque Lancisian fut fondée par Giovanni Maria Lancisi, médecin et archiatre papal, au profit des jeunes médecins stagiaires de l’hôpital Santo Spirito. Sous Alexandre VII (1655-1667), le complexe hospitalier Santo Spirito a été développé davantage, avec la construction de la salle de l’hôpital Alessandrina, qui abrite aujourd’hui le musée de l’histoire de l’art sanitaire.

Sous Benoît XIV (1724-1730), il fut encore agrandi avec la construction de la « voie bénédictine » perdue, démolie au début du XXe siècle en faveur de l’aménagement du pont Vittorio et des berges du Tibre. La façade orientale a été reconstruite sur le modèle de l’ancien hôpital Sixtine et, du côté de la digue du Tibre à Sassia, d’autres bâtiments ont été ajoutés, abritant les services modernes de l’actuel hôpital du Santo Spirito.

Le noyau originel de la collection a été formé dans la seconde moitié du XVIIIe siècle et se composait de matériel utilisé à des fins didactiques dans les cours de théorie technico-scientifique (d’autres musées en Italie conservent ce type de matériel, comme le Palazzo Poggi à Bologne ou La Specola à Florence).
Au cours du XIXe siècle, une série de personnalités importantes se sont succédé, en commençant par Giuseppe Flajani et en terminant par le chirurgien de Pie IX, Giuseppe Costantini, qui se sont consacrés avec passion à la réorganisation et à l’enrichissement de la collection avec de nouvelles collections. Mais à partir de la prise de Rome, la structure perd peu à peu de sa vitalité. En effet, l’hôpital, fondé par le pape Innocent III, avait également pour mission d’enseigner la médecine et était donc doté d’une riche bibliothèque, du théâtre anatomique et de la Speziera.

Ce n’est qu’en 1911, à l’occasion des « Expositions rétrospectives » organisées au Château Saint-Ange pour l’Exposition internationale de Rome, que l’idée de créer le musée actuel a été émise. Dans la section consacrée à l’art sanitaire, une riche exposition d’objets provenant de diverses collections privées avait été mise en place, et une apothicairerie romaine du XVIIe siècle ainsi qu’un laboratoire alchimique (avec une maquette de la porte alchimique qui existait réellement à Rome) avaient également été reconstitués.